隨著中國漁業的發展,對飼料的需求量日益增大,使得魚類飼料工業迅猛發展,飼料中大部分為花生、玉米、大豆等原料,在高溫、潮濕條件下極易受霉菌毒素的污染,其中黃曲霉毒素B1的污染造成的損失尤為嚴重,也是對動物及人類危害最大的霉菌毒素。為此,筆者查閱最新國內外研究資料并進行歸納總結,分別介紹了黃曲霉毒素B1的檢測方法,比較了各種方法在實際應用中的優缺點,并對檢測方法進行了展望,以期為黃曲霉毒素的檢測和研究提供幫助。
1 黃曲霉毒素的基本性質及其危害
黃曲霉素(AFT)是一類化學結構類似的次級代謝產物,均為二呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是一種次生代謝產物[1],是由黃曲霉和寄生曲霉產生,由于在紫外線下熒光顏色的不同,將其分為藍紫色熒光的B族,和黃綠色熒光的G族及其衍生物,見圖1。目前已經分離出20多種,包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等,它們的化學結構類似,但具體結構有所不同,凡是二氫呋喃環末端有雙鍵的毒性較強,按毒性從大到小依次為:AFB1、AFM1、AFG1、AFB2。在食物中黃曲霉素B1最為常見,是目前已知的最強的化學致癌物之一。AFT難溶于水及甲醇、乙醇、氯仿等有機溶劑,在強酸性溶液中稍有分解,在pH值9～10的強堿溶液中可以快速分解成為無毒的鹽,在自然條件下黃曲霉毒素穩定性很強,紫外線條件下對低濃度的黃曲霉毒素有一定的破壞性。
圖1 黃曲霉毒素B1、B2、M1、M2、G1、G2的化學結構
2 黃曲霉毒素的毒理效應及其危害
黃曲霉毒素是目前發現的最強的致癌物之一,其毒性為KCN的10倍,是砒霜的68倍,能使禽類、魚類、靈長類等動物誘發肝癌,主要表現為肝部壞死、出血以及肝硬化等[2,3]。魚類采食黃曲霉毒素后會導致其采食量下降,體重下降,影響營養物質的吸收,與其他外源污染物一樣,長期的黃曲霉毒素攝入會影響動物的免疫系統,抑制動物的自然免疫。早在1993年黃曲霉毒素就被世衛組織列為一級致癌物質[4],國內外科研工作者也對該毒素的研究產生了極大的興趣[5,6],研究表明,用含有濃度為0.015 mg/kg黃曲霉毒素B1的飼料投喂小鼠,68～82周后小鼠肝部發生病變,用含有濃度為0.1 mg/kg黃曲霉毒素B1的飼料投喂鱒魚,26周后出現肝癌[7]。 黃曲霉毒素對人類和動物健康的危害主要是由于黃曲霉毒素抑制體內蛋白質的合成,黃曲霉毒素中產生毒素的重要結構是雙呋喃環[8],該霉毒素對細胞有毒害作用,該毒素首先干擾DNA與mRNA的合成,進而再影響蛋白質的合成,最終導致整個機體的損害[9,10]。黃曲霉毒素只有在機體內代謝活化之后才會表現出劇毒性[11],其中因黃曲霉毒素與DNA的絡合導致的突變而引起的癌癥備受關注。黃曲霉毒素除了對肝臟有影響之外,對其他系統也會產生影響,如生物體攝入黃曲霉毒素后,會破壞其造血功能,導致血液成分的變化,還會導致機體免疫力降低等。魚類攝入含有黃曲霉毒素的飼料后,黃曲霉毒素會通過新陳代謝蓄積在魚體的各個組織,經尿液排出一部分后,仍有大部分殘留在肉中,因此黃曲霉毒素一方面直接影響動物機體健康,同時毒素也會轉移到肉中,通過食物鏈來威脅人類健康[12]。并且,黃曲霉毒素的毒性還可通過母體傳遞,對胚胎免疫系統的發育產生影響,導致胚胎免疫機能受損,具有致畸、致癌作用,所以控制好飼料中黃曲霉毒素的含量,保證水產品的質量安全就是對人類健康的保護。
3 黃曲霉毒素殘留檢測技術
目前現有國內外對于飼料中黃曲霉毒素的檢測方法種類繁多,大多集中于理化檢測法和免疫學檢測法,本文將對現有的黃曲霉毒素檢測方法按照理化檢測法和免疫學檢測法分類進行綜述。
3.1 理化檢測方法
3.1.1 薄層色譜法(TLC)
薄層色譜法是最早檢測黃曲霉毒素的方法,也是現行許多國家的作為國標的檢測方法[13],薄層色譜法是樣品在經過提取、凈化、濃縮、分離后,在特定波長的紫外光照射下,根據其發光顏色的不同判斷B族、G族,根據熒光強度判斷黃曲霉毒素的含量。Marijana[14]利用薄層色譜法測定飼料中單瑞孢霉烯族毒素等,檢出率達到16.8%,含量在0.05～3.4 mg/kg之間。該方法的優點是設備簡單,操作方便,分析成本低,較適合對黃曲霉素B1的定性檢測;其缺點是對檢測的規范和熟練程度要求高,準確度低,且重復性較差。
3.1.2 高效液相色譜法(HPLC)
高效液相色譜法是檢測黃曲霉毒素的國標方法之一,也是一種常用的方法,其原理是以有機溶劑和水混合作為流動相,樣品通過分離、純化和濃縮后上機,通過計算待測樣品的峰面積來判斷樣品中毒素的含量。鄭會超等[15]研究了飼料中黃曲霉毒素的檢測方法,通過免疫親和柱凈化后,用熒光檢測器檢測,可以同時分離飼料中的4種黃曲霉毒素,靈敏度高、重復性好。高效液相色譜法的優點是檢測靈敏度高,重復性好,且檢出限低,缺點是前處理操作復雜、分析成本高、且需要在專業實驗室經專業人員進行檢測,不能滿足快速批量篩查的需求。
3.1.3 親和柱高效液相色譜法(IAC-HPLC)
親和柱高效液相色譜法可以避免薄層色譜法和高效液相色譜法的缺點,通過免疫親和柱與薄層色譜和高效液相色譜相結合,可以在一定程度上提高檢測效率、檢測結果的靈敏度和準確度,達到準確定量。姚兆興等[16]用甲醇、水溶液作為流動相采用親和柱高效液相色譜法提取飼料中的黃曲霉毒素,通過免疫層系柱凈化后,采用高效液相色譜測定黃曲霉毒素的含量,檢出限為0.5 μg/kg,且線性范圍良好,精密度和準確度能夠滿足要求。該方法同樣具有靈敏度高、檢測限低等優點,并且在操作過程中檢測人員無中毒危險。
3.1.4 液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)
液相色譜-質譜聯用法以其是一種結合了液相色譜的分離技術和質譜高靈敏度的特點,是目前應用最廣的一種檢測技術,經常被用作確證方法使用。朱聰英等[17]建立了液相質譜法同時測定飼料中多種黃曲霉毒素的方法,被測樣品中的各組分均得到了有效的分離,檢測靈敏度高,檢出限為0.2 μg/kg,定量限為0.5 μg/kg,檢測回收率為66%～108%,均在允許范圍內。該方法在精密度、靈敏度存在一定優勢,適用于定量、定性檢測,且檢測周期短節省時間,樣品制備簡單。
3.2 免疫學檢測法
3.2.1 酶聯免疫吸附法(ELISA)
利用ELISA檢測黃曲霉毒素的原理是毒素抗原抗體直接的競爭性反應,也是我國測定飼料中黃曲霉素B1的國家標準方法之一[18]。國家標準中該方法的檢出限為0.2 μg/kg。孫清[19]用酶聯免疫方法檢測魚粉中黃曲霉毒素B1,檢測結果與液相色譜串聯質譜法檢測結果相符,且線性范圍良好。ELISA法靈敏度高,操作便捷,分析速度快,并且可以同時處理大批量樣品,但是由于同類分子的相似性,ELISA法容易對結構類似的其它黃曲霉毒素或化學物質產生一定的交叉反應,有可能帶來假陽性、假陰性結果,檢驗精確度有待提高。
3.2.2 免疫膠體金技術(GICT)
免疫膠體金技術的原理是讓待測樣品中的毒素與金標物結合,抑制了抗體和硝酸纖維素膜檢測線上黃曲霉毒素B1偶聯物的免疫反應,使檢測線變淺,通過檢測線顏色變化進行測定[20]。膠體金免疫層析技術的優點為簡單、快速、成本低廉,適用于現場檢測和大規模樣品篩查。但其靈敏度低和不能定量的缺點,也使膠體金免疫層析技術在一些領域內的應用受到限制。目前研究膠體金免疫層析方法與其他儀器結合,建立黃曲霉素B1快速檢測綜合體系將是未來的發展趨勢。
3.2.3 免疫層析法(ICA)
免疫層析法是二十世紀九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術的快速檢測方法,其原理是樣品在毛細管的作用下移動至固定抗體的區域后,該區域會顯示一定顏色。劉艷麗等[21]建立了一種用于檢測黃曲霉毒素B1的免疫層次試紙條,靈敏度為1.0 ng/mL。說明該方法有很好的應用前景。
3.2.4 放射免疫法(PIA)
放射免疫法與酶聯免疫方法的區別只是標記物的不同,放射免疫法的標記物為放射性元素,一般采用元素氚為標記物,使標記物與抗體競爭結合,通過測定樣品放射性的強弱來判斷毒素含量的高低。閆磊等[22]通過PIA法測定牛奶中黃曲霉毒素的含量,得到檢出限為0.25 μg/kg。放射免疫法的優點是測定周期短、前處理簡單,缺點是放射性元素污染問題。
3.2.5 熒光偏振免疫法(FPIA)
熒光免疫分析法是一種定量免疫分析技術,原理是用熒光物質做標記,與待測樣品中的抗原競爭結合抗體,通過結合物熒光偏振程度來判斷樣品中毒素的含量。楊曉涵等[23]利用熒光偏振免疫法檢測茶中黃曲霉毒素的含量,檢測限為20 ng/mL,檢測范圍為92.76～252.32 ng/mL。該方法的優點是操作簡單、檢測速度快、可進行批量檢測,但易出現假陽性,且設備價格昂貴。
3.2.6 時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)
時間分辨熒光免疫分析法是使用鑭系元素為標記物,利用其螯合物發光的特點,通過該技術來測定熒光來判定樣品中的毒素。樊曉播[24]利用時間分辨熒光免疫分析技術檢測大米、黃豆和干果中黃曲霉毒素B1,靈敏度為0.02 ng/mL。該方法在排除非特異熒光干擾的前提下大大提高了靈敏度,同時克服了同位素的污染問題。
3.2.7 免疫傳感器法(IS)
免疫傳感器法是一種基于抗原抗體特異性識別功能而研制的一種生物傳感器。王瑞鑫[25]利用該方法包埋固定抗黃曲霉毒素B1抗體,構建一種基于石墨烯的免疫傳感器,用于測定花生和玉米油中黃曲霉毒素B1,檢出限為0.04 ng/mL,回收率為94%～104%,均在允許范圍內。該方法雖然靈敏度高,但固化抗原抗體技術尚未成熟。
3.3 其他方法
3.3.1 電子鼻法
電子鼻是一種新興的檢測技術,是由傳感系統和自動化識別系統組成的一種電子感官儀器,它是將神經、數學、物理等多方面的理論運用到一起,可以快速辨別氣味和氣體,建立一種氣味的模型,可以檢出樣品的特殊氣味。沈飛[26]利用電子鼻技術檢測糙米中的黃曲霉毒素。這種方法是一種間接的檢測方法,即不是直接檢測樣品中的黃曲霉毒素,而是待樣品污染后檢測其揮發性物質的改變。該方法為檢測提供了一種新的思路,但應用較少,仍需進一步探索。
3.3.2 分子生物學檢測方法(PCR技術)
近年來,隨著分子生物學的發展,PCR技術在霉菌毒素的檢測中得到了廣泛的應用。秦文彥等[27]通過對黃曲霉毒素的基因調控,建立了單管多重PCR檢測黃曲霉毒素的體系,對黃曲霉毒素的DNA樣本進行檢測,靈敏度為1 ng/μL。該方法具有方便快捷且成本低等優點。
4 總結與展望
4.1 總結
魚類飼料中黃曲霉毒素的檢測技術種類繁多,且檢測技術趨于成熟,現將檢測方法總結如表1。
表1 魚類飼料中黃曲霉毒素檢測方法對比 導出到EXCEL
| 類別 | 檢測方法 | 定量/定性 | 優、缺點 |
|
理化 檢測法 |
TLC HPLC LC-MS IAC-HPLC |
定性 定量 定性 定量 定性 定量 定性 |
精密度高 靈敏度高 |
|
免疫學 檢測法 |
ELISA ICA PIA FPIA TRFIA IS 膠體金技術 |
半定量 定性 |
易出現假陽性 |
|
新型方法 |
電子鼻技術 分子生物學檢測法 (PCR技術) |
定性 | 有一定局限 |
新型方法 電子鼻技術
分子生物學檢測法
(PCR技術) 定性 有一定局限性
綜上所述,免疫學檢測法為半定量、定性檢測方法,多應用于初篩或者批量檢測中,準確性稍差;理化檢測方法為定性、定量檢測方法,穩定性、重復性、準確性較高,且液相色譜質譜聯用法為國標的檢測方法之一;近年來新興起來的檢測方法雖然能夠達到檢測效果,但仍需進一步研究。綜合當前研究,液相色譜(HPLC)和液相色譜質譜聯用法(LC-MS)應用最廣。
4.2 展望
本文綜述了多種檢測黃曲霉毒素的方法,如理化檢測方法、免疫學檢測方法以及一些新興的檢測方法,有些雖未涉及到魚類飼料的檢測但是具有十分廣闊的發展前景。密切關注國內外的新技術,推出更適合我國黃曲霉毒素的檢測技術,對加強飼料安全的控制,保障人民的身體健康具有重要意義。
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