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        高效液相色譜技術指標和最新進展

        時間:2021-02-04 11:06:20 作者:admin 點擊:

          HPLC一般都是由輸液系統(泵) 、進樣系統 、 分離系統(柱)、檢測系統、數據處理系統組成。各部分簡述如下:
         
          1、輸液系統(高壓泵)及其重要性
         
          高壓泵是關鍵部件之一,按原理分為兩種類型:一類是恒流泵,一類是恒壓泵。恒流泵,無論色譜柱的阻力如何變化、無論外界有何影響,它輸出的流動相的流速可以基本保持不變,這正好是HPLC系統工作的基本要求;而恒壓泵輸出的基本上是恒定不變的壓力,在正常情況下,由于HPLC系統的阻力不會變化,所以恒壓也可以達到恒流的效果。但是由于色譜柱、溫度等可能會有變化,所以可能導致流量變化,這是HPLC使用者不希望看到的結果。所以一般來講,恒流泵比恒壓泵好(橫流泵的使用多于恒壓泵)。目前我國有近20家企業在生產各種不同類型的HPLC,但是基本上都是采用恒流泵;
          高壓泵的質量直接影響整個HPLC的質量,是用戶關注的核心部件之一。HPLC高壓泵的重要性及使用者對高壓泵的具體要求如下:
         
          (1)耐高壓
         
          耐高壓是HPLC系統對高壓泵的基本要求之一,一般來講,平均粒徑為4μm左右的填料、內徑為5mm左右的色譜柱,當流動相流速為1-3mL/min時,要求輸液泵的最高工作壓力達到34.47-41.36Mpa(5000-6000psi);目前國際上商品HPLC泵的最高工作壓力一般為41.36Mpa (5000psi)左右。但隨著填料粒徑的不斷減小,粒徑為1-2.5μm范圍的小粒徑無孔色譜填料的應用推廣,流動相在色譜柱中的阻力會更大,所以,2004年國際上出現了超高壓液相色譜,要求輸液泵能夠耐更高的壓力。目前市場上已有達到68.94Mpa(10000psi)的高壓恒流泵(如:Altex 100A)。
         
          (2)穩定性好、脈動小
         
          輸液高壓泵的穩定性和脈動大小會直接影響HPLC系統的穩定性(漂移和重復性)、影響系統的噪聲、降低靈敏度,特別是HPLC系統采用電化學檢測器和示差等檢測器,或進行梯度分離時更加重要,因此目前國際上很多高壓泵的壓力脈動都可以控制在1%以內。
         
          (3) 流量連續可調、流量范圍寬
         
          目前國際上HPLC的高壓泵,大多數流動范圍可以達到0.001-10.0mL/min(制備色譜的流量更大,有時要求達到數千mL/min),可以同時滿足各種不同內徑的色譜柱的分析工作要求。
         
          (4) 流量重復性好
         
          很多HPLC的泵的流量重復性可以達到0.07%(RSD)。但是重復性與測試方法有關,目前國際上一般采用兩種方法測試:一是重量法,收取泵的單位時間里的流出液,在天平上直接稱其重量,判斷重復性;二是保留時間法,根據保留時間的長短,來判斷流量的重復性。在HPLC的分析工作中,其定性分析一般是根據保留時間。高壓泵的重復性(RSD)是極其重要的指標之一,也是影響HPLC整機系統重復性的一項非常重要的性能技術指標。
         
          (5)死體積小
         
          高壓泵的死體積會影響HPLC的分析精密度和準確度,特別是影響梯度洗脫的效果,一般總是希望死體積越小越好。因為高壓泵的死體積小,有利于溶劑的快速置換,并且有利于把系統的氣泡及時排出。
         
          (6) 流量準確度高
         
          HPLC高壓泵的流量準確度很重要,直接影響分析測試數據的重復性(可靠性)。目前國內外HPLC的泵流量重復性一般在1%左右(與測試方法有關),最好的可達到0.06%(采用保留時間法;如美國waters、日本島津、中國普析通用的高壓泵等就是如此)。
         
          (7) 具有梯度洗脫功能
         
          目前國際上的HPLC儀器,一般都具有梯度洗脫功能;因為,往往等度洗脫不能解決的分析工作,如果采用梯度洗脫的方法,就可能很好的解決問題。因此,HPLC的使用者,往往需要儀器的高壓泵具有流速程序和梯度洗脫程序。
         
          除上述幾點外,對HPLC的高壓泵的要求還有耐用、流速可控程、具有壓力檢測保護功能、維修方便等。雖說不是所有的泵都要求具有上述要求,但是很多泵具有這些功能,一般都能滿足液相色譜分析工作的要求。
         
          2、分離系統(色譜柱)
         
          人們一般所講的分離系統主要指色譜柱及其附件,它是一個非常重要、非常復雜的核心部分。一般液相色譜柱的結構如下圖所示,包括柱管(大多采用不銹鋼制作)、填料(后面將詳細討論)、接頭(一般用不銹鋼制作)、卡套(一般用不銹鋼制作)、壓帽、密封環、濾片、螺絲(一般用不銹鋼制作)、連接管道(一般用不銹鋼制作)等等。
         
          HPLC的色譜柱主體組成(結構)如下:
         
          1)色譜柱結構:色譜柱主體組成一般如下圖所示:
         
        02.jpg
         
        圖中:1-色譜柱的塑料保護頭;2-柱頭螺絲;3-刃環;4-密封環;5-濾片(篩板);6-柱體(不銹鋼管);7-色譜柱填料。
         
         
          色譜柱的篩板(過濾板)一般是用不銹鋼或鈦合金材料制作,其孔徑一般在0.2-20μm之間,孔徑大小主要取決于柱填料的粒度,它是一個非常重要的零件,它可以防止填料漏出。同時,防止色譜柱工作時雜質進入柱內引起分離效果下降,甚至容易引起色譜柱堵塞等等。色譜柱與輸液管連接處一般需要使用不銹鋼制作的卡套和不銹鋼制作的固緊接頭螺釘,它們也非常重要,否則色譜柱系統會漏液,結果使柱壓下降、流動相或樣品漏出,嚴重影響分析測試結果,甚至不能進行分析測試工作。
         
          2)色譜柱分類:
         
          從類型上來說,色譜柱可以分為制備型和分析型兩大類,一般分析型的柱使用最多。如果細分,色譜柱又可以分為常規柱、窄徑柱、毛細管柱、制備柱和半制備柱等等。為提高分析速度,有人經常使用短柱,其柱長5-10cm,填料粒徑多為3μm左右。很多分析工作者比較強調分析靈敏度,因此發展了窄徑柱、毛細管柱和微徑柱。這些柱子的優點是:所需樣品少、所需流動相少、靈敏度高、容易控制溫度。但是它們對檢測器的流動池、柱外的管道、接頭、進樣閥等要求大大提高了。
         
          色譜柱的柱效是最重要的關鍵指標,一般都取決于固定相的性能和裝柱技術。一般HPLC的色譜柱固定相(填料)大致有三種:硅膠或以硅膠為基質的填料、聚合物填料和無機物填料。正相色譜柱大多采用硅膠類填料,反相色譜柱則多以硅膠為基質組成的官能團類的填料。以聚合物為填料的色譜柱最大的特點是PH值可在1-14之間都能用,疏水性強。但無機填料色譜柱一般只是限于特殊用途,比較少用。
         
          因為HPLC的樣品都為溶液,而溶液受溫度影響很大,例如:溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的柱效、流動相的粘度都會產生影響。如果溫度升高,可能會提高溶液在流動相中的溶解度,可以降低分配系數K;降低流動相粘度可以降低柱壓,有利于保護色譜柱,延長色譜柱的壽命。但是,溫度不能太高,否則會產生氣泡。
         
          HPLC工作者還必須注意不同的溫度,對色譜柱的保留時間、分離效果,及檢測器的靈敏度都會有影響,特別是對示差折光器的靈敏度、最小檢出限的影響很大。所以,很多HPLC特別注意對恒溫系統的設計,這些都是HPLC設計者、使用者應該重視的問題。
         
          作者的長期實踐證明:色譜柱的技術含量很高,它除了與色譜柱的結構有關外,更加重要的還有:既與固定相的性能有關,又與裝柱時的填充料和填充技術有關。有些使用者根據使用要求自己裝色譜柱,大多數使用者都是使用已經裝好的商品色譜柱。不管是哪種柱,在使用前一定要對色譜柱進行認真的考察;使用期間或放置一段時間后,也要重新檢查、測試。這個問題目前國內很多HPLC使用者很不了解或很不重視;他們以為買來的色譜柱,一定就是合格的、好用的色譜柱,并不知道它還有與系統是否相匹配的問題;不知道它會對前面的高壓泵、后面的檢測器有什么影響等等。所以在使用過程中,總是磕磕碰碰,不能得到最佳的分析結果。
         
          HPLC的色譜柱(分離柱)是極其重要的部件之一,根據填料的不同一般可分為:反相柱、正相柱、其它柱三類,分別簡述如下。
         
          (1)反相色譜柱:它是使用最多的一種色譜柱;一般約占75%左右; 其中,C18柱約占 65%;C8柱占15%左右;苯基柱<5%。反相色譜是目前應用得最為廣泛的一種高效液相色譜方法。C18 在反相色譜中應用得最為廣泛,大概超過一半以上。
         
          (2)正相色譜柱:正相色譜柱也經常被使用,約占20%左右。
         
          (3)其它色譜柱 (手性柱, 離子交換柱): 約占10%左右。
         
          要用好、保護好色譜柱,是一個需要特別重視的問題,如果稍有不慎,就有可能降低色譜柱的柱效、縮短色譜柱的壽命,甚至損壞色譜柱。
         
          3、檢測系統
         
          檢測器種類很多也非常重要,但是使用最多的是光學類檢測器,占比約75%左右,這里重點光學類檢測器。
         
          1)光學類檢測器基本功能:提供準確的波長、提供足夠小的檢測限(靈敏度,這是用戶最關心的問題之一)、提供小的噪聲、飄移和重復性,給出最終檢測結果。
         
          2)最常用HPLC檢測器的類型
         
          在國內外的科技界,很多色譜工作者認為高壓泵和色譜柱是HPLC的核心,檢測器只是一種光譜儀器,沒有分離就不成為色譜。所以,通常認為高壓泵和色譜柱最重要。而光譜工作者認為光譜儀器是HPLC的核心,沒有它,分析檢測結果什么也不知道,高壓泵只是輸液、色譜柱只是分離,關鍵要靠檢測器檢測才有測試結果,所以檢測器最重要。作者認為上述兩種說法都不完全正確,應該說HPLC系統中每個部分都重要,千萬不能偏看哪個部分,否則將得不到可靠的分析檢測數據。
         
          目前,國內外科技工作者最常用的檢測器有以下幾種:蒸發光檢測器、分子熒光檢測器、示差折光檢測器、各類紫外可見光譜檢測器、各類質譜檢測器、各類AAS(原子吸收光譜)檢測器、各類原子熒光檢測器等等。在各類聯用技術中,凡與HPLC的泵、柱聯用的儀器,都可以稱之為檢測器。
         
          3)光學類檢測器的主要技術指標:
         
          光學類檢測器是所有檢測器中使用最多的一種,它的主要技術指標如下:
         
          (1)波長范圍:長波和短波兩端決定儀器的適用范圍,限制或決定儀器的適用性。例如:一般只有氘燈的紫外檢測器,就不能測試吸收峰在618nm的強致癌物質孔雀石綠,以及吸收峰在200nm的紫外吸收物質,因為氘燈沒有618nm這根譜線,而在200nm時能量弱、信噪比差。
         
          (2)波長準確度:影響摩爾吸光系數、影響儀器的靈敏度,比較儀器時很重要。
         
          (3)波長重復性:影響分析數據的重復性。
         
          (4)光譜帶寬:大家不大注意,它是分析誤差來源之一,一般采用譜線輪轂法測試。
         
          (5)噪聲:非常重要,一般光譜儀器有多大的噪聲,就可能在測試結果中增加多大的誤差。
         
          有些儀器采用軟件平滑噪聲,作者認為不是好辦法。因為平滑時一是信號也損失了一部分,二是硬件的噪聲并沒有去掉。測試結果表面上噪聲小了,其實信噪比沒有變化。所以,作者認為應該從算法上著手,采用目前國際上一種最先進的利用軟件、算法降噪技術,這種技術只降噪聲,不影響信號,這是光譜儀器研發工作者應該重視的問題。
         
          (6)穩定性(含漂移、重復性):它直接限制光譜儀器的可靠性。
         
          (7)光度范圍:應該注意多少濃度范圍內能給出準確數據。
         
          (8)量程:應重視最靈敏量程,不能用最大量程測試儀器的靈敏度(后面將有論述)。
         
          4) 幾種特別值得重視的HPLC檢測器
         
          (1)最常用的:紫外檢測器(UVD)(占70%左右)、熒光檢測器(FLD)(占10%) 、視差折光檢測器(RID )(占3%)、其他檢測器(如質譜等等,占17%)。
         
          (2)還有目前使用非常多的、質量型檢測器:蒸發光散射檢測器--ELSD, (已上藥典,可以替代RID)。
         
          (3)用戶目前特別關注的新型檢測器:質譜檢測器、化學發光檢測器、放射性檢測器、光電導檢測器、旋光檢測器、電噴霧檢測器(最新的質量檢測器,后面還將詳細討論)等等。
         
          (三)HPLC整機幾項最關鍵的性能技術指標的測試方法
         
          1、靈敏度的測試方法
         
          HPLC的靈敏度可定義為:一、定量的物質,通過HPLC的檢測器時,儀器所給出的信號大小就叫做該HPLC的靈敏度,有時也稱為響應值。對使用者來講,總是希望HPLC儀器有較高的靈敏度,因為靈敏度高,就意味著對等量的同一樣品進行檢測時,儀器有較大的輸出信號。但是,靈敏度的高低,并不能表示HPLC儀器的檢測能力。只有檢出限,才能表示儀器的最大檢測能力。
         
          HPLC靈敏度的測試方法:主要根據信噪比的定義進行測試。一般取信號等于或大于噪聲2倍時的檢測量或濃度(信號強度)作為HPLC的信號大小。信號與噪聲二者相除即為儀器的信噪比(靈敏度,但是要求S/N≧2)。
         
          2、檢測限測試方法
         
          講HPLC的指標、給出HPLC的譜圖,應該實事求是的給出使用的靈敏度量程(一般使用最靈敏量程),給出樣品濃度(一般是噪聲的3倍左右),才能說明儀器的檢測限或靈敏度。
         
          3、光學類檢測器噪聲的測試方法
         
          HPLC的噪聲是一種與被測樣品無關的、隨機輸出的信號。國際上對噪聲的定義、測試方法各異。例如:美國材料協會制訂的測試標準(ASTM),規定噪聲分為長噪聲、短噪聲、和超短噪聲三種。長噪聲是指每小時內有6個至60個變化周期的噪聲,所以,測定時間至少應該測試一小時;短噪聲是指每小時內有1個至10個變化周期的噪聲,所以,測定時間至少應該測試10分鐘至60分鐘內;超短噪聲是指每分鐘內有10個以上的變化周期的噪聲,所以,測定時間應該大于1分鐘。
         
          從使用者的角度看,噪聲又分為靜態噪聲和動態噪聲。其測試方法如下:
         
          1)靜態噪聲測試:冷態開機(關機2小時后開機),預熱30分鐘,連續測試1小時。在這1小時里,任取10分鐘(包含最差的峰-峰值),在這10分鐘里取峰對峰值(P-T0-P)的最大值,就是儀器的噪聲。但是,10分鐘里的峰對峰(P-T0-P)值,不同于10分鐘里的任一地方的峰-峰(P-P)值,即:“10分鐘里的峰對峰”值,不等于瞬時的峰-峰(P-P)值,測試數據前面應加“±”符號。
         
          注意:開機30分鐘后,儀器調整到最靈敏度檔(如:對量程為0.005-3.0AUFS的儀器,取0.005AUFS,即縱坐標設置為0.005A);設置波長λ=250nm(有人設置500 nm,但最好測試250 nm);設置0 Abs(即時間掃描,吸光度從0點開始測試);光譜帶寬(SBW)=2nm(固定光譜帶寬的儀器不需選擇)。
         
          在上述條件下,連續測試1小時(用儀器上的CRT指示輸出,或用數字電壓表監測)。在1小時內,任取10分鐘的峰對峰值(P-T0-P),其最大者前面加“±”符號,即是儀器的噪聲。目前,國際上大多數科技工作者,基本上采用這種方法測試HPLC儀器的靜態噪聲。
         
          有些科技工作者,認為在10分鐘的峰對峰值(P-T0-P)前如果要加“±”符號,就應對峰-峰值的絕對值先除“2”。這種做法是不妥的,會低估儀器的噪聲。因為噪聲是隨機的,可能是“+”值也可以是“-”值。
         
          上述儀器條件的設置,在有些儀器上是不需要的,因為由于計算機的發展和普遍應用,很多儀器的坐標設置,完全由儀器的計算機自動設置。
         
          2)動態噪聲測試:
         
          作者在研發檢測器和使用HPLC時所采用的測試動態噪聲方法如下:連接恒流泵、液相色譜分離柱和檢測器。在恒流泵和檢測器中有移動相(流動相)流動。
         
          具體操作方法如下:
         
          冷態開機,預熱30分鐘,設恒流泵的流速1mL/min;檢測器設置:儀器調整到最靈敏度檔(如:0.005AUFS;即縱坐標設置為0.005AU);波長λ=250nm(有人設置500 nm,但最好測試250 nm)、0 Abs(即時間掃描,吸光度和時間都從0點開始測試),光譜帶寬(SBW)=2nm(固定光譜帶寬的儀器不能選擇),連續測試1小時,可以用儀器上的CRT指示噪聲在這1小時里,任取10分鐘(包含最差的峰-峰值),在這10分鐘里取峰對峰值(P-T0-P)的最大值,就是儀器的噪聲。但是,10分鐘里的峰對峰(P-T0-P)值,不同于10分鐘里的任一地方的峰-峰(P-P)值,即:“10分鐘里的峰對峰”值,不等于瞬時的峰-峰(P-P)值。測試數據前面應加“±”符號。目前,國際上基本上采用這種方法測試HPLC儀器的動態噪聲。有時候,為了節省時間,也可以在漂移測試的基礎上檢測噪聲。但是開機時間就不是30分鐘,而是2小時。這樣所得測試數據稍小于開機30分鐘的數據(因此,給出數據時要說明方法),數據處理方法仍如上所述。
         
          3)目前國內外的HPLC制造商,往往在儀器樣本上給出的都是檢測器的靜態噪聲,同時注明了儀器的狀態(檢測器空池)。這樣做,對于使用者了解整個儀器系統中的檢測器性能有利,也是可以的。但是不符合使用者的總體要求,因為使用者的總體要求是:整個HPLC系統(包括泵、柱、檢測器)處在使用狀態(動態)的情況下,整機的噪聲有多大。所以,作者認為靜態噪聲可以給出,也可以不給出,但是動態噪聲必須給出。
         
          注意:噪聲測試時,國際接軌的做法是在500nm。但是有些廠商卻給出700nm處測試的噪聲,這也是不對的。因為波長短,能量大;500nm處的能量比700nm處大,所以在700nm處測試的噪聲,數據會偏小,數據不真實。
         
          4)中國的HPLC國家標準(2011版)和計量檢定規程JJG705-2002也規定了噪聲的測試方法,但是分別都還有一些值得推敲的問題,請大家自己參閱。
         
          5)這里特別需要提出的是:目前有些國外HPLC生產廠商,為了吸引用戶,制造了一些違背儀器學理論的指標。例如:國外某廠商,在招標中給出HPLC的噪聲時,先采用計算機對噪聲進行平滑,并且采用最大量程測試,結果給出的HPLC噪聲非常小、譜圖基線非常平直、譜峰尖而陡直,給人的印象是世界一流的HPLC。其實不然,給出的數據和譜圖都是虛假的。如果用盲樣進行比對測試,因為他們的HPLC的噪聲大,信噪比差,靈敏度差,所以立即敗下陣來。
         
          我國三聚氰胺國標的建立過程中的比對測試結果就是如此,專家們從三家公司(兩家外企,一家國產儀器公司(普析通用公司))的三種HPLC全方位比對測試的結果(標樣由國家標物中心提供)中,最后選用了國產北京普析通用的早期HPLC產品L6作為國家建標的儀器(L6是《原料乳三聚氰胺快速測定--液相色譜法》國家標準中采用的唯一國產儀器),其根本原因是L6的比對測試數據準確可靠、噪聲小、S/N高、性價比高等等。
         
          4、穩定性(基線漂移和重復性)測試方法:
         
          這里包括儀器的靜態基線漂移和動態基線漂移的測試方法:
         
          一般來說,使用者不關心單個檢測器的靜態指標,所以,可以不專門測試檢測器的靜態基線漂移。但是,作者認為設計、制造者應該測試靜態基線漂移這個指標,測試方法與測試整機(系統)的動態基線漂移完全相同。
         
          動態基線漂移測試方法如下:冷態開機,預熱2小時,連續測試1小時。1小時內的最大最小值之差就是動態漂移。(也有測試更長時間的,例如作者在FLD檢測器研發時,為了考察儀器的長時間漂移,連續測試48小時,儀器的漂移小于5mV)。
         
          5、重復性及其測試方法:與漂移測試方法相同,對儀器進行多次測試(作者認為一般是5-7次),其數據的符合程度就是重復性,一般用RSD表示。
         
          6、量程范圍及其測試方法
         
          1)定義
         
          儀器能適用測量的范圍或儀器能滿足測量要求的范圍叫量程范圍。其表示方法為AUFS(Absorbance Unit Full Scale)或AU/FS(Absorbance Unit/Full Scale)。80年代以前,也有很多人用OD(光密度)這個概念表示Abs(Absorbance),即用ODFS來表示UVD的量程,但是OD不符合光對物質吸收的物理概念,不符合儀器學理論,所以,目前國際上已經廢除“OD”概念,不能再使用“ODFS”了。
         
          在實際的日常分析工作中,也有化學工作者用具體的化學物質來描述HPLC的量程。但是不同物質,由于摩爾吸光系數不同,表現出的靈敏度也不同,所以作者認為用具體的化學物質來描述HPLC的量程不符合儀器學理論的要求。作者認為,給出AUFS最合適,其最大優點是這種表示方法與樣品的性質無關,便于比較同一類型檢測器的性能優劣。但是這種表示方法對使用者來說不大直觀、不大方便。目前,國際上的HPLC儀器的量程范圍一般為:0.005-2.5AUFS(例如Waters的HPLC)。少數優質儀器的下限為0.001AUFS,但是有些儀器給出0.001-3.0AUFS的量程是有水分的,因為UVD的雜散光一般都比較大,而雜散光是光吸收類分析儀器主要分析誤差的來源,它主要限制被分析樣品濃度(吸光度)的上限。所以,HPLC的UVD給出0.001-3.0AUFS的量程一般是不準確的。
         
          目前,國內外很多HPLC儀器的UVD生產廠商不給儀器的量程,這是不妥的。因為,不給量程范圍就意味著不知道檢測器的靈敏度(下限),不知道多少吸光度時儀器能達到滿度。當然,目前有很多HPLC儀器的UVD生產廠商,給出了儀器對某一物質的最小檢測濃度或最小檢測量,這在某種程度上也可以反映儀器的靈敏度,并且對使用者來說,比較方便、比較直觀。但是,這種表示方法只是對某一物質而言,特別是會帶來樣品處理產生的誤差、容易低估儀器噪聲的影響,因此,從儀器學理論的角度來看是不科學的。
         
          2)量程范圍測試方法
         
          目前,國際上對HPLC的UVD的量程范圍設計指標,一般在0.005-3.0AUFS內。作者在研制HPLC的UVD檢測器時,用原上海大華儀表廠生產的XWT-204記錄儀的1V檔測試。當對數放大器的差分放大器的總輸出為1V時,記錄儀滿度(100格)。當儀器的有效光電信號從0.005-3.0V時,均可保證對數放大器的輸出為1V;此時,這個0.005-3.0V對應的吸光度為0.005-3.0Abs。要求從0.005-3.0Abs時,光度準確度都能保證在1%以內(即1V±10mv)。如此測量3次并取均值,即是HPLC的量程范圍(0.005-3.AUFS)。
         
          目前,國內外許多制造商都用萘或者蒽來測試HPLC系統的靈敏度,這種做法也可以,但是從儀器學理論角度考量,作者認為不科學。因為:①、不能給出儀器的測量范圍,只能給出萘的最小檢測濃度;②、試樣的配制會帶來很多誤差;③、這種方法所作的測試,實際上是計算出來的靈敏度,而不是測試出來的真正的靈敏度,不能反應儀器真正的靈敏度。如果實際測試,肯定比計算的數據大很多。④、不與國際接軌,不便比較不同儀器的性能。雖說近幾年國內外采用此方法的科技工作者比過去多,但是不能掩蓋方法的局限性。所以,最好的方法還是給出儀器的測量范圍。
         
          還有人用靜態噪聲的2倍或3倍來計算最小檢測濃度,這樣計算出來的結果,同樣是不真實的。因為從儀器學理論角度來看,一般在正常情況下,最小檢測濃度是在系統處在動態的情況下測試的,所以計算最小檢測濃度就必須用動態噪聲,而不能用靜態噪聲。
         
          還有人測試HPLC的最小檢測濃度時,采用一些計算公式(如:Cmin=2NC/H×20,式中:Cmin 為最小檢測濃度,N為儀器的噪聲;C為濃度,H為峰高),計算時不考慮移動相的流速,這是不妥的。不考慮移動相的流速或計算公式中去掉移動相的流速,就意味著是靜態的最小檢測濃度,而使用者需要的是系統的動態最小檢測濃度。所以作者認為這種計算方法很不合理,對使用者來講是沒有意義的,這種計算方法不可采用。
         
          (四)HPLC儀器的最新進展
         
          1、二維及多維液相色譜儀的發展:美國EKSIGENT公司和日本KYA TECH公司生產的納升級二維高效液相色譜儀,其組合了納米微柱和二維液相色譜技術,可直接用于蛋白質組學、基因組學研究工作中。
         
          2、毛細管和納升高壓液相色譜儀的發展,美國DIONEX公司生產Ulti Mate毛細管和納升高效液相色譜儀,可進行微柱、毛細管柱和納升柱三種微柱液相色譜分析。
         
          3、超高壓液相色譜儀(UPLC)自從2004年WATERS公司推出ACQUITY UPLC后,JASCO、AGILENT、THERMO-FISHER SCIENTIFIC、SHIMADZU、DIONEX、HITACHI、上海通微等都先后推出了各自的超高效液相色譜議。
         
          4、新型的電噴霧檢測器的問世,它是最新的質量檢測器之一
         
         
          淋洗液從HPLC柱子進入 Corona (1) →在氣腔中被氮氣或空氣霧化 (2) →小液滴進入干燥管 (3) →大液滴進入廢液管 (4) →干燥的顆粒進入混合腔(5) →另一路氣流經過帶電Corona體(6) →帶電氣體和干燥的顆?;旌鲜诡w粒帶電 (7) →離子阱把多余的電荷去除(8) →帶電顆粒進入采集器,電荷被高靈敏度靜電計測量(9)→信號傳輸到色譜數據軟件(10)
         
          5、新型的HPLC儀器不斷問世
         
          目前,HPLC儀器面臨三大挑戰:高速度、高靈敏度、高分離效率。所以,近幾年各國的科技工作者都很重視對HPLC儀器的研發。近幾年,我國的有關生產廠商在這方面取得了令人矚目的成就,例如:
         
          1)從HPLC的色譜柱填料這個核心部件入手,研發成功了優質的、新型的LC5190超高效液相色譜儀(UPLC)。
         
          很多UPLC采用2微米填料的分離柱,柱效比常規HPLC提高了3倍,柱壓上升了9倍。但是,因為色譜柱縱向溫度梯度分布改變,導致色譜峰增寬、分離效率下降,有時還會引起出峰順序的變化。突破了一系列關鍵技術、采用了多種專利技術:他們采用3微米的新型核殼型分離填料色譜柱,使系統壓力降低到常規HPLC范圍,解決了2微米分析柱的不足,保證了UPLC超高效的分離分析結果的同時,降低了柱壓,研發成功了全新的超高效液相色譜儀。該儀器的理論塔板數與采用2微米的全多孔型柱效相同,但是壓力只有其1/2左右。特別是儀器的性價比、長期穩定性、可靠性等都提高了,維修也更加簡便了。該儀器的高精度輸液系統、低殘留進樣系統、精準的溫控柱溫箱和高靈敏度紫外檢測器、熒光檢測器等保證了儀器的先進性、可靠性。儀器具有智能化工作站系統,可以全面滿足用戶的各種應用需求,符合GMP/GLP要求。
         
          2)超快速高效液相色譜儀
         
          該儀器為國內最早推向市場的超快速高效液相色譜儀,與常規HPLC相比,分離能力強,出峰對稱性更好,基線更穩定,分辨率更高,分析時間大大縮短,降低了客戶成本。
         
          該儀器的輸液系統最大輸出壓力:80MPa,流量范圍:0.001-5.000mL/min;流量設定值誤差:Ss≤± 1%(水,20℃, 1mL/min,10MPa); Ss≤±2%(水,20℃, 1mL/min,40MPa)。流量穩定性誤差:SR≤ 0.3%(1mL/min)(10MPa)。
         
          3)LC-100液相色譜儀
         
          第三代LC-100可選擇分析型系統、半制備型系統、制備型系統。新增全新溶劑管理器,可實現在二元梯度系統基礎上輕松切換至4-8種溶劑,并可選配脫氣單元及柱溫箱,大大提升用戶體驗??蛇x擇手動進樣或自動進樣系統,數據工作站分析軟件可根據客戶需求提供兩個版本的選擇,符合GMP、FDA、3Q等認證需求。
         
          4)高效微流電色譜儀和定量毛細管電泳儀問世
         
          高效微流電色譜儀為國家科技部“十二五”重大攻關項目,是國際首創的一種新型HPLC儀器;在柱效、分離速度等很多方面都優于UPLC,其柱效比UPLC高10倍、5秒鐘可以分離5個芳香烴(一般HPLC需要10-20秒)。該儀器總體優于UPLC,又是一個國際首創。定量毛細管電泳儀也是國際首創(一般毛細管電泳儀,定量分析精度很差)。
         
          HPLC儀器的進展發展很快,遠不止如上所述。因篇幅所限,此不贅述。
         
          (五)幾個有關問題
         
          1、分析儀器和儀器分析工作者應該“不忘各自的初心,牢記各自的使命”。分析儀器制造者的初心是什么?應該是為用戶服務,做出的儀器質量好,穩定可靠,能滿足使用者的使用要求。分析儀器工作者的使命是什么?應該是做出的儀器好用,質量穩定可靠。所以,分析儀器制造商應該盡量到用戶中去,認真去了解用戶的需求,儀器制造商必須將儀器專業技術與儀器應用技術緊密結合,這樣,儀器制造商才能作出優質儀器、才能提供可靠性好的儀器,才能保證儀器使用者得到最佳分析檢測結果。
         
          儀器使用者的初心是什么?應該是得到最佳分析測試數據。儀器使用者的使命是什么?就是用好儀器,認真學習或搞清楚儀器的性能指標的物理意義、對分析誤差的影響,認真選擇儀器條件、認真做好樣品前處理,努力將儀器用在最佳條件下。這樣,才能得到最佳分析檢測數據,才能得到分析誤差最小的分析檢測結果。
         
          我國目前的現狀是:做儀器的人,不知道使用者在如何使用儀器,不知道使用者對儀器的具體要求,所以,做出的儀器就不大好用或者不好用,這是制造者與使用者脫節的原因。而使用者不知道制造者在如何制造儀器,不知道儀器的性能指標的物理意義、對分析誤差的影響,所以,買儀器時要求指標越高越好,結果根本用不上。實驗室里儀器堆得滿滿的,但是很多儀器用不上,造成大大的浪費。所以,不忘初心,牢記使命,制造儀器和使用儀器的科技工作者緊密結合非常重要。
         
          2、沒有理論指導的儀器研發和生產工作都是閉著眼睛抓麻雀,一定要重視儀器學理論;
         
          從事HPLC儀器研發和使用的科技工作者,只有重視儀器學理論才能做好HPLC儀器、才能用好HPLC儀器。儀器學理論是一把金鑰匙,一通百通,它可以使你做出穩定可靠的優質HPLC儀器,使你在使用HPLC儀器時,能夠調整好最佳儀器條件、保證得到準確可靠的分析檢測數據。
         
          目前我國的20多家HPLC儀器生產商和廣大HPLC用戶,對儀器學理論重視不夠,基本上不了解HPLC各項性能指標的物理意義和它們對分析誤差的影響,特別是不懂得HPLC儀器的各項指標如何影響分析檢測數據的誤差。這是中國分析儀器及其應用落后國外先進水平或與國外存在差距的主要原因之一。因此,儀器學理論非常值得廣大科技工作者們重視。
         
          3、從儀器學、分析化學和應用實踐的要求來講,目前國產HPLC要求基本上都能滿足使用要求,并且深受國外科技工作者青睞。國產高檔HPLC產品已經出口到國外(包括發達國家和發展中國家);而國人卻盲目迷信進口HPLC,大量進口國外的HPLC,中國的HPLC主市場仍被外國儀器占領,實在令人費解。中國的科技工作者,應該從民族高度看國產儀器和進口儀器。在購買、使用各類HPLC儀器時,應該要有愛國情懷,要有骨氣,要大膽使用能滿足使用要求的國產儀器。
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